外源性硫化氢对APP/PS1双转基因小鼠APP代谢途径的影响与机制研究

【摘要】第一部分：APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马CBS蛋白的表达和活性以及内源性H2S的水平目的：检测3、6、9、12月龄APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马中CBS蛋白的表达和活性以及内源性H2S的水平。方法：用免疫组化方法检测CBS蛋白的表达情况；采用硫电极法检测APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马中CBS酶活性以及内源性H2S的水平。结果：与3月龄转基因小鼠相比，CBS神经元在6月龄小鼠中排列有序，神经元数目及CBS蛋白表达无明显减少，其CBS酶活性及内源性H2S水平无明显降低；而CBS神经元在9、12月龄小鼠皮质和海马中排列紊乱，神经元数目及CBS蛋白表达减少，CBS酶活性及内源性H2S水平明显降低，以12月龄小鼠最为明显。结论：9、12月龄APP/PS1转基因小鼠皮质和海马中CBS神经元排列紊乱，神经元数目减少，CBS蛋白表达减少，并且CBS蛋白酶的活性以及内源性H2S水平也降低，以12月小鼠最为明显。第二部分：外源性硫化氢对APP/PS1双转基因小鼠APP代谢途径的影响目的：探讨外源性H2S能否改善APP/PS1双转基因小鼠的认知功能损害；认知功能改善的小鼠脑组织中Aβ1-40及Aβ1-42的水平是否有相应的改变；小鼠的认知功能改善是否与H2S使APP的代谢从淀粉样物质途径即β-途径转向α-途径即非淀粉样物质途径,从而降低Aβ有关；最后确定H2S对小鼠起以上作用的最佳剂量。方法：每间隔一日给4和10月龄APP/PS1双转基因小鼠腹腔注射10、20、50μmol/kgNaHS，连续两个月；对照组转基因鼠腹腔注射等量生理盐水。分别在小鼠6月和12月龄时，首先用水迷宫(MWM)方法检测各组小鼠的认知情况；再用免疫组化方法检测capase3的表达情况，以确定NaHS对转基因小鼠神经元有无毒性；其次用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Aβ1-40、Aβ1-42水平，免疫组化方法检测Aβ1-42的表达情况；最后用Westernblot检测APP代谢的β-途径中BACE-1、PS1酶蛋白及相应产物C99和α-途径ADAM10、ADAM17酶蛋白及相应产物C83的表达情况。结果：①在MorrisWaterMaze实验中6及12月龄NaHS处理小鼠和各自的对照组相比均显示游泳速度无明显差异(p>0.05)。在定向航行实验中，与同龄对照组相比，90s内到达平台的潜伏期和游泳距离，6月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠显示第2、3、4天的潜伏期和游泳距离明显下降(p<0.05)；而10和20μmol/kgNaHS处理小鼠中与对照组相比，其潜伏期及游泳距离无明显差别(p>0.05)。与同龄对照组相比，90s内到达平台的潜伏期和游泳距离在12月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠第2、3、4天中均下降(p<0.05)；10和20μmol/kgNaHS处理小鼠中的潜伏期与对照组相比无区别(p>0.05)。在第5天的空间搜索实验中，与同龄对照组相比，6和12月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠在目标象限均分别显示了较高的时间百分比及更多的越过原平台次数(p<0.05)。②capase3的表达在6和12月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠脑组织分别明显减少。③与同龄对照组相比，Aβ-40和Aβ-42的水平在6和12月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠脑组织中明显降低(p<0.05)。同时Aβ-42斑块的大小和数量在6和12月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠脑组织中也明显减少。Aβ-40和Aβ-42降低的水平在10和20μmol/kgNaHS处理小鼠中与对照组相比无明显差异(p>0.05)。④β-分泌酶即BACE-1蛋白的表达水平在6月龄50μmol/kgNaHS的处理小鼠脑组织中降低(p<0.05)。BACE-1蛋白的表达水平也在12月龄20和50μmol/kgNaHS处理小鼠脑组织中明显降低(p<0.05)。与以上结果相对应，与同龄对照组相比，β-途径中的代谢产物C99的蛋白表达在20和50μmol/kgNaHS处理小鼠中也降低(p<0.05)。⑤与对照组相比，γ-分泌酶PS1蛋白表达在6和12月龄20和50μmol/kgNaHS处理小鼠脑组织中均明显下降(p<0.05)。PS1蛋白的表达在6和12月龄10μmol/kgNaHS处理小鼠中均无明显下降(p>0.05)。⑥α-分泌酶的活性成分ADAM17的表达水平在6月龄NaHS处理小鼠中没有改变(p>0.05)；然而与同龄对照组相比，ADAM17的表达在12月龄NaHS处理小鼠中随着浓度的增加而逐渐升高，在50μmol/kgNaHS处理小鼠脑组织中尤其明显(p<0.05)。而α-分泌酶的另一个活性成分ADAM10的表达水平在6和12月龄各组NaHS处理转基因小鼠脑组织中均没有任何变化(p>0.05)。与以上结果相对应，相应的α-途径的代谢产物C83蛋白水平在6月龄各组转基因小鼠中虽无明显变化(p>0.05)；但C83蛋白水平的表达在12月龄50μmol/kgNaHS处理小鼠明显升高(p<0.05)。结论：50μmol/kgNaHS处理能改善6和12月龄转基因鼠的认知功能损害，转基因小鼠脑组织中Aβ-40和Aβ-42的水平及Aβ-42形成的斑块数量、大小也相应地下降；50μmol/kgNaHS处理降低了APP代谢β-途径中BACE1和PS1酶蛋白及相应的产物C99的表达，同时使α-途径中的ADAM17酶蛋白和相应的产物C83升高，使APP的淀粉样代谢途径向非淀粉样代谢途径转变，从而降低Aβ的生成改善转基因小鼠的认知情况。第三部分：PI3K/AKT、MAPK/ERK通路在外源性硫化氢对APP代谢影响中的作用目的：探讨外源性硫化氢作用于APP代谢途径中PI3K/AKT、MAPK/ERK通路的作用。方法：首先用免疫组化方法检测12月龄正常鼠，转基因鼠，50μmol/kgNaHS处理4周转基因小鼠脑组织中capase3的表达，以确定NaHS对转基因小鼠神经元有无破坏性作用，然后用Westonblot方法检测各组小鼠脑组织中BACE1,PS1,ADAM17,pAKT,pP38MAPK,pERK,pJNK的蛋白表达情况。再对11月龄转基因小鼠腹腔注射50μmol/kgNaHS的同时侧脑室注射5mg/kg、10mg/kgPI3K/Akt抑制剂LY2940024周；11月龄转基因小鼠腹腔注射50μmol/kgNaHS的同时腹腔注射2.5mg/kg、5mg/kgERK抑制剂PD980594周。用水迷宫方法检测转基因鼠、50μmol/kgNaHS处理转基因鼠、注射NaHS同时给予PI3K/Akt通道抑制LY294002或ERK抑制剂PD98059各处理转基因小鼠的认知功能情况。再用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠脑组织中Aβ1-40、Aβ1-42的水平，免疫组化方法检测Aβ1-42形成的斑块大小及数目。最后用Westonblot方法检测注射NaHS同时给予PI3K/Akt通道抑制LY294002或ERK抑制剂PD98059各处理转基因小鼠脑组织中BACE1，PS1和ADAM17蛋白表达情况。结果：①正常12月龄小鼠脑组织中capase3表达较少，在12月龄AD小鼠中有大量capase3表达,但在给12月龄AD小鼠腹腔注射NaHS50μmol/kgNaHS4周后，capase3的表达较同龄转基因小鼠明显减少。②与正常小鼠相比，BACE1和PS1的表达在12月龄AD小鼠脑组织中明显升高，而ADAM17蛋白的表达明显降低(p<0.05)。给APP/PS1转基因小鼠腹腔注射NaHS后，BACE1和PS1的表达下降而ADAM17的表达上升(p<0.05)。③与正常小鼠相比，pP38MAPK在12月龄小鼠脑组织中明显上升(p<0.05)。腹腔注射NaHS50μmol/kgNaHS4周后pP38MAPK表达明显下降。pAkt、pERK、pJNK蛋白的表达在正常小鼠和转基因小鼠脑组织中无明显差别(p>0.05)。在给12月龄转基因小鼠腹腔注射NaHS50μmol/kgNaHS4周后，pAkt和pERK蛋白的表达明显上升，pJNK蛋白的表达无变化。④所有NaHS处理转基因小鼠、NaHS+LY294002处理转基因小鼠、NaHS+PD98059处理转基因小鼠与转基因小鼠相比显示相同的游泳速度。在定位航行中，与12月转基因小鼠相比，50μmol/kgNaHS处理转基因小鼠在90s内到达平台第3、4天的潜伏期明显降低(p<0.05)。然而NaHS+5mg/kg和NaHS+10mg/kgLY294002转基因小鼠90s内到达平台的潜伏期与转基因小鼠相比无明显差异(p>0.05)。与转基因小鼠相比，NaHS+2.5mg/kg和NaHS+5.0mg/kgPD98059转基因小鼠90s内到达平台的潜伏期均下降(p<0.05)。NaHS+2.5mg/kg和NaHS+5.0mg/kgPD98059转基因小鼠之间的潜伏期无明显差异(p>0.05)。在第5天的空间搜索实验中，在目标象限的时间百分比及跨过原平台的次数，与转基因小鼠相比，NaHS处理转基因小鼠明显增多(p<0.05)；NaHS+5mg/kg和NaHS+10mg/kgY294002处理转基因小鼠与转基因小鼠相比无差异(p>0.05)。跨过原平台的次数与转基因小鼠相比，NaHS+2.5mg/kgPD98059和NaHS+5.0mg/kgPD98059转基因小鼠明显增多(p<0.05)。⑤与转基因小鼠相比，腹腔注射50μmol/kgNaHS转基因鼠脑组织中Aβ-40和Aβ-42的水平下降(p<0.05)。NaHS+5mg/kg和NaHS+10mg/kgLY294002转基因小鼠脑组织中Aβ-40和Aβ-42的水平与转基因小鼠相比无明显差异(p>0.05)；NaHS+2.5mg/kg和NaHS+5.0mg/kgPD98059转基因小鼠与转基因小鼠相比，Aβ-40和Aβ-42的水平明显降低(p<0.05)；而NaHS+2.5mg/kg和NaHS+5.0mg/kgPD98059转基因小鼠之间Aβ-40和Aβ-42的水平无明显差异(p>0.05)；同样，Aβ-42形成斑块的数目及大小与以上结果一致。⑥在腹腔注射NaHS并侧脑室注射PI3K/Akt抑制剂5mg/kg和10mg/kgY294002的转基因小鼠中，与仅腹腔注射NaHS的转基因小鼠相比，BACE1和PS1蛋白的表达明显增高(p<0.05)；然而，ADAM17蛋白的表达无明显变化。⑦与腹腔注射NaHS转基因小鼠相比，腹腔注射NaHS和MAPKs/ERK抑制剂PD98059处理转基因小鼠脑组织组中BACE1、PS1和ADAM17蛋白表达无差异(p>0.05)。并且NaHS+2.5mg/kg和NaHS+5.0mg/kgPD98059组间BACE1、PS1及ADAM17的蛋白表达无任何差别(p>0.05)。结论：50μmol/kgNaHS腹腔注射降低转基因小鼠脑组织中BACE1和PS1蛋白同时升高ADAM17蛋白的表达；并降低转基因小鼠脑组织中pP38MAPKs的表达，增高pAKT,pMAPKs/ERK蛋白的表达。对PI3K/Akt和MAPKs/ERK通道分别用LY294002和PD98059抑制后，PI3K/Akt通道被抑制，BACE1和PS1蛋白升高，但ADAM17蛋白无改变。MAPKs/ERK被抑制后，BACE1和PS1蛋白和单纯注射NaHS一样仍下降，ADAM17蛋白升高。提示NaHS经过PI3K/Akt而不是MAPKs/ERK通道降低BACE1和PS1蛋白。
【作者】何选丽；
【导师】晏勇；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】内源性硫化氢(H2S)；胱硫醚-β-合酶(CBS)；APP/PS1转基因；NaHS；β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)；早老素1(PS1)；解聚素金属蛋白酶10(ADAM10)；解聚素金属蛋白酶17(ADAM17)；外源性硫化氢；β位淀粉样前体蛋白裂解酶1；早老素1；磷脂酰肌醇-3激酶；丝裂原活化蛋白激酶；

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